Pengukuran spektrofotometri HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air dan Ekstraksi Uji Fitokimia

Please download to get full document.

View again

of 9
242 views
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.

Download

Document Related
Document Description
kembali (dilakukan 2 kali dan filtrat dikumpulkan ke dalam labu takar, lalu ditera dengan aseton). Sebanyak 20 ml filtrat hasil hidrolisis dan 20 ml akuades dimasukkan ke dalam corong pisah, lalu diekstraksi
Document Share
Document Transcript
kembali (dilakukan 2 kali dan filtrat dikumpulkan ke dalam labu takar, lalu ditera dengan aseton). Sebanyak 20 ml filtrat hasil hidrolisis dan 20 ml akuades dimasukkan ke dalam corong pisah, lalu diekstraksi dengan etil asetat (ekstraksi yang pertama dengan 15 ml etil asetat, ekstraksi kedua dan ketiga dengan 10 ml etil asetat). Fraksi etil asetat dikumpulkan dalam labu takar 50 ml, kemudian ditera dengan etil asetat. Pengukuran spektrofotometri Sebanyak 10 ml larutan fraksi etil asetat dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml, lalu direaksikan dengan 1 ml larutan AlCl 3 2% b/v dan ditera dengan larutan asam asetat glasial 5% v/v dalam metanol. Pengukuran larutan dilakukan pada panjang gelombang nm. Kurva standar dibuat dengan kuersetin murni dengan konsentrasi 0, 0.5, 2.5, 5, 7.5, dan 10 ppm. Tahap ini dapat dilihat secara jelas pada Lampiran 8. HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air dan Ekstraksi Dengan mengetahui kadar air suatu sampel, maka dapat diperkirakan cara penyimpanan terbaik bagi sampel dan menghindari pengaruh aktivitas mikrob. Suatu bahan relatif stabil dari serangan mikrob jika kandungan air sampel tersebut kurang dari 10%. Kadar air daun asam jawa sebesar 9.2%, sedangkan kadar air rimpang kunci pepet sebesar 5.5%(Lampiran 9). Kadar air daun asam jawa dan rimpang kunci pepet yang diperoleh kurang dari 10% sehingga dapat terhindar dari serangan mikrob selama penyimpanan. Jumlah air yang terkandung dalam daun asam jawa dan rimpang kunci pepet tentunya tidak menentu karena banyak faktor yang mempengaruhi, yaitu kelembaban udara, perlakuan terhadap bahan, waktu pengambilan sampling, dan besarnya penguapan (evaporasi) (Harjadi 1987). Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu maserasi dengan air deionisasi dan etanol 70% sebagai larutan pengekstrak. Metode ini berdasarkan pada penelitian Doughari (2006). Rendemen yang diperoleh dari ekstrak air dan etanol daun asam jawa berturut-turut sebesar 20.5 dan 12.2%, sedangkan ekstrak air dan etanol rimpang kunci pepet sebesar 19.2 dan 16.7% (Lampiran 10). Metode maserasi ini menggunakan banyak pelarut dan waktu yang lama dalam prosesnya, tetapi memiliki keuntungan, yaitu dapat menjaga agar kandungan senyawa dalam sampel yang tidak tahan panas, tidak rusak, dan sampel yang diekstraksi bisa langsung dalam jumlah yang banyak. Rendemen dipengaruhi oleh kadar air. Semakin tinggi kadar air sampel, maka semakin tinggi rendemen ekstrak sampel tersebut. Air dan etanol digunakan sebagai larutan pengekstrak karena kedua pelarut ini biasa digunakan untuk analisis pendahuluan obat dan aman untuk dikonsumsi lebih lanjut. Selain itu, alkohol merupakan pelarut serba guna yang sangat baik untuk ekstraksi pendahuluan karena dapat mengekstraksi senyawa polar dan nonpolar (Harborne 1987). Penggunaan air sebagai larutan pengekstrak juga disebabkan oleh air dapat mengekstraksi senyawa-senyawa yang bersifat polar karena air bersifat polar, sedangkan etanol mempunyai dua gugus yang berbeda kepolarannya, yaitu gugus hidroksil yang bersifat polar dan gugus alkil yang bersifat nonpolar. Adanya kedua gugus tersebut pada etanol diharapkan senyawa-senyawa dengan tingkat kepolaran yang berbeda akan terekstrak dalam etanol. Ekstrak ini selanjutnya diuji kandungan senyawa metabolit sekunder, toksisitasnya terhadap larva udang, daya inhibisi terhadap aktivitas lipase pankreas secara in vitro, dan penentuan kadar flavonoid total dari ekstrak terbaik daya inhibisinya. Uji Fitokimia Uji kualitatif fitokimia terhadap daun asam jawa kering, ekstrak kasar air, dan etanol yang diperoleh digunakan untuk mengetahui jenis senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam sampel dan golongan senyawa bioaktif yang terkandung di dalam setiap ekstrak sampel. Golongan senyawa dalam ekstrak kasar dapat ditentukan dengan melihat perubahan warna setelah ditambahkan pereaksi yang spesifik untuk setiap uji kualitatif. Hasil penapisan fitokimia daun asam jawa (Tabel 1) menunjukkan bahwa ekstrak air dan etanol daun asam jawa hampir semua mengandung senyawa metabolit sekunder yang dianalisis, kecuali triterpenoid. Triterpenoid adalah suatu senyawa yang bersifat nonpolar sehingga tidak terdeteksi pada air dan etanol karena air dan etanol bersifat polar. Hasil fitokimia ini sesuai dengan Doughari (2006), tanaman asam jawa mengandung senyawa tanin, alkaloid, saponin, seskuiterpena, dan flobatamin melalui uji fitokimia. Senyawa metabolit sekunder yang terekstrak dengan etanol lebih banyak daripada yang terekstrak dengan air. Hal ini dapat disebabkan oleh sifat alkohol yang mampu melarutkan senyawa polar dan nonpolar. Tabel 1 Hasil uji fitokimia daun asam jawa Daun asam Golongan jawa Ekstrak Senyawa Kering Air Etanol Alkaloid Flavonoid Saponin Steroid Triterpenoid Tanin Keterangan: + = terdeteksi mengandung senyawa metabolit tersebut. - = tidak terdeteksi mengandung senyawa metabolit tersebut. Tabel 2 Hasil uji fitokimia rimpang kunci pepet Golongan Rimpang kunci pepet Ekstrak Senyawa kering Air Etanol Alkaloid Flavonoid Saponin Steroid Triterpenoid Tanin Keterangan: + = terdeteksi mengandung senyawa metabolit tersebut. - = tidak terdeteksi mengandung senyawa metabolit tersebut. Uji fitokimia terhadap rimpang kunci pepet (Tabel 2) menunjukkan bahwa ekstrak air dan etanol mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, dan saponin. Akan tetapi, selain senyawa-senyawa tersebut, ekstrak air rimpang kunci pepet juga mengandung tanin, sedangkan pada ekstrak etanol mengandung triterpenoid. Hasil fitokimia ini sesuai dengan Anonim (2008), rimpang kunci pepet mengandung minyak atsiri yang berwarna kuning muda, alkaloid, saponin, flavonoid, dan polifenol. Senyawa tanin tidak terdeteksi pada ekstrak etanol rimpang kunci pepet, sedangkan pada serbuk rimpang kunci pepet kering dan ekstrak air terdeteksi mengandung senyawa tanin. Hal ini disebabkan oleh tanin merupakan senyawa polifenol yang sifatnya polar sehingga terekstrak dalam pelarut air dan serbuk keringnya. Tidak terdeteksinya tanin pada ekstrak etanol diduga karena tidak seragamnya umur daun yang digunakan sebagai sampel. Daun yang lebih tua akan mempunyai kadar metabolit sekunder yang lebih banyak dibandingkan dengan yang muda. Senyawa triterpenoid tidak terdeteksi pada serbuk kunci pepet kering, akan tetapi pada ekstrak etanolnya terdeteksi mengandung senyawa triterpenoid. Hal ini disebabkan oleh jumlah triterpenoid yang terdapat dalam rimpang kunci pepet sangat sedikit dan triterpenoid bersifat nonpolar sehingga hanya menunjukkan hasil yang positif pada ekstrak etanol. Kepolaran etanol lebih kecil dibandingkan dengan air sehingga triterpenoid lebih terekstrak dalam etanol. Uji Toksisitas terhadap Larva Udang Uji toksisitas larva udang pada penelitian ini dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk mengamati potensi bioaktivitas dan toksisitas dari masing-masing sampel sehingga dapat ditentukan konsentrasi ekstrak yang aman untuk pengujian. Uji ini menggunakan larva udang karena uji ini mudah, murah, praktis, dan cukup akurat. Jumlah larva udang yang mati akibat pengaruh ekstrak ditunjukkan pada Lampiran 11. Tabel 3 Nilai LC 50 ekstrak air dan ekstrak etanol sampel terhadap larva A. salina Contoh Ekstrak LC 50 (ppm) Daun asam jawa Air Etanol Rimpang kunci pepet Air Etanol Suatu ekstrak tanaman akan bersifat bioaktif apabila mempunyai nilai LC 50 kurang dari 1000 ppm (Meyer et al. 1982). Berdasarkan Tabel 3 dapat diketahui bahwa ekstrak air daun asam jawa, ekstrak etanol daun asam jawa dan rimpang kunci pepet berpotensi sebagai senyawa bioaktif dan dapat dijadikan sebagai obat karena menghasilkan LC 50 kurang dari 1000 ppm sehingga pada konsentrasi yang rendah telah mampu mematikan 50% populasi larva udang A. salina, sedangkan ekstrak air rimpang kunci pepet mempunyai bioaktivitas yang rendah karena untuk mematikan 50% pupulasi larva udang diperlukan konsentrasi ekstrak di atas 1000 ppm. Ekstrak yang memiliki potensi bioaktif yang paling tinggi dan bersifat toksik adalah ekstrak etanol daun asam jawa. Hal ini disebabkan oleh ekstrak etanol daun asam jawa memiliki nilai LC 50 yang paling rendah, yaitu ppm yang berarti pada konsentrasi yang kecil ekstrak ini dapat mematikan setengah populasi dari larva udang A. salina. Ekstrak yang memiliki potensi bioaktif yang tinggi belum tentu mempunyai daya inhibisi yang tertinggi. Hal ini disebabkan oleh nilai LC 50 hanya digunakan sebagai batas konsentrasi tertinggi pada penentuan ragam konsentrasi ekstrak dalam uji enzimatik sehingga formulasi obat akan lebih aman jika konsentrasi yang dibuat di bawah LC 50. Uji In vitro Ekstrak terhadap Aktivitas Hidrolisis Lipase Pankreas Penentuan aktivitas lipase pankreas dilakukan dengan menggunakan asam oleat dengan konsentrasi 4.25 µmol sebagai standar dengan nilai serapan sebesar Perlakuan standar dimulai pada tahap penambahan kloroform-heptana (1:1) yang selanjutnya sama seperti prosedur uji aktivitas hidrolisis lipase pankreas. Substrat yang umumnya digunakan dalam uji in vitro lipase pankreas adalah substrat murni, seperti triolein dan trilinolein. Menurut Desnuelle dan Savary (1963), pengujian in vitro terbaik terhadap aktivitas lipase pankreas adalah dengan menggunakan substrat trigliserida rantai panjang yang tidak larut dalam air dalam bentuk emulsi, seperti minyak wijen dan bimoli. Martatilofa (2008), menguji kandungan dari 2 buah substrat, yaitu minyak bimoli dan wijen yang menunjukkan bahwa bilangan asam minyak wijen, yaitu 3.8 mg KOH/g minyak, jauh lebih tinggi daripada bilangan asam minyak Bimoli sebagai pembanding, yaitu 0.43 mg KOH/g minyak. Bilangan asam menunjukkan kadar asam lemak bebas pada minyak. Semakin tinggi bilangan asam, maka semakin tengik minyak tersebut. Pengujian aktivitas lipase pankreas pada minyak wijen sebesar μmol/l.menit, sedangkan pada minyak Bimoli sebesar μmol/l.menit. Kandungan utama dari minyak wijen adalah asam oleat dan asam linoleat. Berdasarkan hal tersebut, maka substrat yang digunakan pada penelitian ini adalah minyak wijen. Hasil optimasi lipase pankreas yang dilakukan oleh Martatilofa dan Silitonga (2008) menunjukkan bahwa enzim ini memiliki aktivitas optimum pada ph 8, waktu inkubasi 45 menit, dan suhu 40 C. Menurut Hadvary et al. (1988), lipase pankreas juga memiliki aktivitas optimum pada ph 8. Konsentrasi lipase pankreas yang digunakan sebesar μg/μl, konsentrasi substrat yang digunakan sebesar 16.2 μg/μl, dan panjang gelombang yang menunjukkan serapan maksimum sebesar 435 nm sehingga penelitian ini menggunakan kondisi optimum tersebut. Suhu dan ph optimum dari suatu enzim sangat penting untuk diketahui karena pada keadaan tersebut enzim mempunyai stabilitas dan aktivitas yang optimum. Ekstrak dianalisis dengan melarutkan ekstrak ke dalam larutan bufer fosfat ph 8. Tujuan ekstrak dilarutkan dalam bufer fosfat ph 8, yaitu menghilangkan efek samping pelarut yang mungkin dapat mempengaruhi aktivitas lipase pankreas. Penambahan bufer fosfat ph 8 bertujuan mengkondisikan substrat yang akan dihidrolisis dan mempertahankan ph lipase pankreas supaya tetap ber-ph 8 sehingga hidrolisis tetap dalam keadaan optimum. Penambahan kloroform bertujuan menghentikan reaksi hidrolisis substrat oleh lipase pankreas, sedangkan penambahan campuran kloroform-heptana (1:1) bertujuan mengekstraksi asam lemak (asam oleat) yang dihasilkan dari hidrolisis minyak wijen yang terdapat dalam larutan campuran. Penambahan pereaksi tembaga bertujuan mengikat asam lemak bebas (asam oleat) hasil hidrolisis lipase pankreas, sedangkan natrium dietilditiokarbamat bertujuan mengkompleks asam lemak (asam oleat) yang dihasilkan dari reaksi hidrolisis lipase pankreas. Seluruh ekstrak diuji aktivitas lipase pankreas secara in vitro dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada berbagai konsentrasi dalam menghambat aktivitas lipase pankreas dan dihitung daya inhibisinya. Ragam konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 100, 150, 200, 250, dan 300 ppm serta masing-masing konsentrasi dilakukan dengan tiga kali ulangan. Pengujian pada konsentrasi bervariasi ini ditunjukkan untuk melihat pengaruh penambahan konsentrasi ekstrak terhadap peningkatan daya inhibisi dan penurunan aktivitas lipase pankreas. Selain itu juga ditunjukkan untuk melihat besarnya daya inhibisi ekstrak pada serangkaian konsentrasi di bawah nilai toksisitasnya (LC 50 ) dan dilakukan pengamatan aktivitas lipase pankreas tanpa penambahan ekstrak (kontrol negatif) untuk melihat pengaruh inhibisi ekstrak tersebut terhadap aktivitas lipase pankreas. Aktivitas lipase pankreas dengan penambahan ekstrak dihitung dengan membandingkan nilai serapannya dengan serapan standar, yaitu asam oleat (Lampiran 7), kemudian aktivitas lipase pankreas dihitung sebagai μmol asam oleat/l.menit. Daya inhibisi ekstrak dilihat dari penurunan aktivitas lipase pankreas yang dihitung dari selisih nilai aktivitas lipase pankreas kontrol negatif (tanpa ekstrak) dengan zat uji. Pengaruh penambahan ekstrak air dan etanol 70% daun asam jawa pada berbagai konsentrasi ditunjukkan oleh Gambar 4. Berdasarkan semua ragam konsentrasi memiliki kemampuan sebagai inhibitor lipase pankreas, daya inhibisinya lebih besar dibandingkan dengan kontrol positif, dan peningkatan daya inhibisi lipase pankreas tidak berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi ekstrak. Artinya, peningkatan konsentrasi ekstrak yang ditambahkan tidak selalu meningkatkan daya inhibisinya. Berdasarkan pernyataan di atas tipe inhibitor lipase pankreas ini tidak dapat disimpulkan karena pada penelitian ini tidak dilakukan penelitian yang lebih lanjut tentang kinetika enzim. Kontrol positif memiliki daya inhibisi sebesar 10.6% pada konsentrasi 100 ppm, ekstrak air daun asam jawa memiliki daya inhibisi yang terbesar pada konsentrasi 300 ppm sebesar 39.4%, dan ekstrak etanol memiliki daya inhibisi terbesar pada konsentrasi 150 ppm sebesar 49.0% (Gambar 4). Artinya, ekstrak air dan etanol daun asam jawa pada konsentrasi 300 dan 150 ppm mampu menghambat akivitas enzim lipase pankreas untuk menghidrolisis asam oleat sebesar 39.4 dan 49.0%. Day a inhibisi ( % ) Konsentrasi (ppm) 42.3 Kontrol positif Ekstrak air daun asam jawa Ekstak etanol daun asam jawa Gambar 4 Daya inhibisi kontrol positif, ekstrak air, dan ekstrak etanol daun asam jawa terhadap aktivitas lipase pankreas. Berdasarkan Gambar 4 terlihat bahwa ekstrak etanol daun asam jawa memiliki daya inhibisi yang paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak air daun asam jawa dan kontrol positif terhadap aktivitas lipase pankreas manusia. Hal ini disebabkan oleh jumlah kandungan senyawa metabolit sekunder yang dimiliki oleh ekstrak etanol lebih banyak dibandingkan dengan ekstrak air daun asam jawa. Hasil ini senada dengan penelitian yang dilakukan oleh Han et al. (1999) dan Rahardjo et al. (2005) menyatakan bahwa ekstrak air tanaman teh oolong dan ekstrak etanol daun jati belanda dapat menghambat aktivitas lipase. Hal ini senada juga dengan Silitonga (2008) yang menyatakan bahwa ekstrak etanol daun jati belanda dan rimpang bangle memiliki daya inhibisi lebih besar dibandingkan dengan ekstrak air. Hal ini sama dengan kemampuan ekstrak etanol CT-II dari buah Cassia nomame yang menunjukkan bahwa ekstrak etanol dari buah tersebut mampu menghambat aktivitas lipase pankreas porsin secara in vitro pada konsentrasi 0.07 sampai dengan 0.1 mg/ml dengan daya inhibisi sebesar 50% dan triolein sebagai substrat, serta pengaruh antiobesitas pada tikus yang mempunyai lemak yang tinggi secara in vivo, sehingga dapat digunakan sebagai zat tambahan untuk pencegahan obesitas dan hipertrigliseridemia pada manusia (Yamamoto et al. 2000). Daya inhibisi (% ) Konsentrasi (ppm) Kontrol positif Ekstrak air kunci pepet Ekstrak etanol kunci pepet Gambar 5 Daya inhibisi kontrol positif, ekstrak air, dan etanol rimpang kunci pepet terhadap aktivitas lipase pankreas. Hasil pengujian ekstrak rimpang kunci pepet terhadap aktivitas lipase pankreas terlihat pada Gambar 5. Berdasarkan Gambar 5 terlihat bahwa tidak semua ragam konsentrasi ekstrak etanol rimpang kunci pepet memiliki kemampuan sebagai inhibitor lipase pankreas, sedangkan semua ragam konsentrasi ekstrak air rimpang kunci pepet memiliki kemampuan sebagai inhibitor lipase pankreas. Daya inhibisi ekstrak air dan etanol rimpang kunci pepet pada konsentrasi 100 ppm lebih besar dibandingkan dengan kontrol positif. Ekstrak air rimpang kunci pepet memiliki daya inhibisi maksimum pada konsentrasi 200 ppm dengan daya inhibisi sebesar 65.1% dan ekstrak etanol pada konsentrasi 250 ppm dengan daya inhibisi sebesar 36.5%. Ekstrak etanol rimpang kunci pepet pada konsentrasi 200 dan 300 ppm memiliki daya inhibisi bernilai negatif dan aktivitas lipase pankreas meningkat. Hal ini diduga ekstrak yang digunakan masih berupa ekstrak kasar yang belum murni karena masih berupa gabungan dari beberapa golongan senyawa yang kemungkinan memiliki respon yang berbeda atau bahkan bersifat antagonis satu sama lain dalam menghambat aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi tertentu. Berdasarkan hasil tersebut terlihat bahwa ekstrak air memiliki daya inhibisi yang paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol. Walaupun dari hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol rimpang kunci pepet lebih banyak mengandung senyawa metabolit sekunder. Hasil ini didukung oleh penelitian Han et al. (1999) yang menyatakan bahwa ekstrak air teh oolong dapat menghambat aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi μg/ml dan senyawa kafein diidentifikasi sebagai aktivator noradrenalin yang menyebabkan lipolisis. Lee et al. (2005) menyatakan bahwa senyawa krosetin dan krosin yang diisolasi dari ekstrak air Gardenia fructus berpotensi sebagai inhibitor lipase pankreas secara in vitro dengan nilai IC 50 sebesar 2.1 dan 2.7 mg/ml (triolein sebagai substrat), krosin dan krosetin juga berpotensi dalam aktivitas hipolipidemik (antiobesitas) pada Triton WR- 133 atau minyak jagung yang diberikan pada tikus yang mempunyai lemak tinggi secara in vivo. Daya inhibisi tertinggi ekstrak etanol kedua tanaman melebihi daya inhibisi tertinggi ekstrak etanol beberapa tanaman lainnya terhadap aktivitas lipase, seperti ekstrak etanol daun jati belanda, yaitu 25.3% pada konsentrasi 60 ppm dan rimpang bangle sebesar 29.2% pada konsentrasi 100 ppm (Silitonga 2008), serta daun kemuning sebesar 22.8% pada konsentrasi 30 ppm (Martatilofa 2008). Daya inhibisi ekstrak etanol lebih besar pada daun asam jawa karena pada ekstrak etanol lebih banyak senyawa yang terekstrak dan senyawa tersebut dapat menghambat aktivitas lipase pankreas, sehingga meningkatkan pengaruh penghambatan terhadap enzim tersebut, sedangkan ekstrak air pada rimpang kunci pepet mempunyai daya inhibisi yang paling besar dibandingkan dengan ekstrak etanol. Senyawa-senyawa yang diperkirakan dapat menghambat aktivitas lipase pankreas pada ekstrak air dan ekstrak etanol daun asam jawa, yaitu flavonoid, saponin, steroid, dan tanin. Senyawa yang diduga dapat menghambat aktivitas lipase pankreas pada ekstrak air rimpang kunci pepet, yaitu flavonoid, tanin, dan saponin, sedangkan senyawa yang diduga dapat menghambat aktivitas ekstrak etanol rimpang kunci pepet, yaitu flavonoid, saponin, dan triterpenoid. Senyawa flavonoid terbukti dapat menghambat aktivitas lipase secara in vitro, di antaranya yaitu yang terdapat pada rimpang bangle (Iswantini et al. 2003) dan galangal (Shin et al. 2003). Saponin juga terbukti dapat menghambat aktivitas lipase baik secara in vitro maupun in vivo, yaitu yang terdapat pada daun Thea sinensis dan rimpang Panax japonicus (Han et al. 2001dan 2005). Han et al. (2001) menyatakan bahwa senyawa teasaponin yang terdapat dalam daun Thea sinensis dapat menghambat hidrolisis triolein yang diemulsi dengan lesitin, Triton X-100 atau 4-metilumbeliferioleat. Han et al. (2005) menyatakan bahwa senyawa chikusetsusaponin III, chikusetsusaponin IV, 28- deglukosilchikusetsusaponin IV, dan 28- deglukosilchikusetsusaponin yang diisolasi dari fraksi saponin total rimpang Panax japonicus mampu menghambat aktivitas lipase pankreas pada k
Search Related
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks